Los vectores virales y su relación con la bioseguridad en el laboratorio / Viral vectors and their relationship with biosafety in the laboratory / Vetores virais e sua relação com a biossegurança no laboratório

Los vectores virales constituyen un amplio grupo de agentes usados en los laboratorios de biología molecular y microbiología, para transferir ácido nucleico externo dentro de una célula "blanco". Estos laboratorios requieren medidas de bioseguridad para proteger al personal, el ambiente de trabajo y la población en general de exposiciones no intencionales a estos agentes biológicos. Esta revisión incluye definiciones y generalidades sobre los vectores más usados, así como consideraciones sobre los niveles de bioseguridad necesarios, teniendo en cuenta tanto la constitución genética del vector original, como el tipo de inserto que se quiera clonar y expresar en una determinada célula. Además se describen diferentes propiedades de los vectores como el tropismo, las distintas formas de transmisión, la estabilidad del agente viral y su persistencia, que resultan claves para determinar el grupo de riesgo. Dentro de las condiciones de trabajo adecuadas se incluyen medidas de contención, ensayos de riesgo ambiental y una breve descripción de la biocustodia. Finalmente se destaca el papel de los Comités de Bioseguridad Institucional, como elemento crítico en las actividades necesarias para impedir las exposiciones y proteger al personal del laboratorio y al medio ambiente.

Viral vectors are a broad group of agents used in molecular biology and microbiology laboratories to transfer exogen nucleic acid. These labs require biosafety measures designed to protect their staff, the population and the environment that may be unintentionally exposed to hazardous organisms. This review includes general properties of known vectors, variations in biosafety levels in relation to original vector genetics and the type of insert to be cloned and expressed in a determined cell. It is also important to consider other issues such as transmission, stability and persistence to determine the vector risk group. Under adequate working conditions, containment measures, risk assays and a short description on biosecurity are included. Finally the function of Institutional Biosafety Committees is a critical element to advise on measures needed to prevent exposures and protect laboratory workers and the environment.

Os vetores virais constituem um amplo grupo de agentes utilizados nos laboratórios de biologia molecular e microbiologia para transferir ácido nucleico externo para uma célula "alvo". Esses laboratórios exigem medidas de biossegurança para proteger o pessoal, o ambiente de trabalho e a população em geral de exposições não intencionais a esses agentes biológicos. Esta revisão inclui definições e generalidades sobre os vetores mais comumente usados, bem como considerações sobre os níveis de biossegurança necessários, levando em consideração a constituição genética do vetor original e o tipo de enxerto a ser clonado e expresso numa célula específica. Além disso, são descritas diferentes propriedades dos vetores, como o tropismo, as diferentes formas de transmissão, a estabilidade do agente viral e a sua persistência, dados-chave para a determinação do grupo de risco. As condições de trabalho adequadas incluem medidas de contenção, testes de risco ambiental e uma breve descrição da biocustódia. Finalmente, o papel das Comissões Institucionais de Biossegurança é destacado como um elemento crítico nas atividades necessárias para prevenir exposições e para proteger o pessoal de laboratório e o meio ambiente.

Naturally occurring compounds elicit HIV-1 replication in chronically infected promonocytic cells.

Since antiretroviral therapy suppresses but does not eradicate HIV-1 infection, methods to purge viral reservoirs are required. Many strategies involve the reactivation of chronically HIV infected cells to induce the expression of integrated viral genome. In this study, five bioactive compounds, the plant derivatives 1-cinnamoyl-3,11-dihydroxymeliacarpin (CDM), nordihydroguaiaretic acid (NDGA), and curcumin (Cur) and the synthetic stigmasterol analogs (22S,23S)-22,23-dihydroxystigmast-4-en-3-one (compound 1) and (22S,23S)-3 ß -bromo-5 α ,22,23-trihydroxystigmastan-6-one (compound 2), were evaluated for their ability to elicit HIV replication in promonocytic (U1) and lymphocytic (H9+) HIV-1 chronically infected cells. The results revealed that natural compounds CDM, NDGA, and Cur were able to increase HIV-1 p24 antigen, determined by ELISA, only in latently infected promonocytic cells. CDM would reactivate HIV from latency by modulating the release of IL-6 and TNF- α , since the amount of both cytokines measured through ELISA significantly increased in U1 treated cells. Besides, NDGA increased ROS production, which might be related to the increase on p24 level observed in NDGA treated U1. These findings suggest that CDM, NDGA, and Cur might be candidates for further studies on latency-reversing therapeutics to eliminate latently HIV-1 reservoirs.

Apoptosis resistance in HIV-1 persistently-infected cells is independent of active viral replication and involves modulation of the apoptotic mitochondrial pathway.

BACKGROUND: HIV triggers the decline of CD4+ T cells and leads to progressive dysfunction of cell-mediated immunity. Although an increased susceptibility to cell death occurs during the acute phase of HIV infection, persistently-infected macrophages and quiescent T-cells seem to be resistant to cell death, representing a potential reservoir for virus production. RESULTS: Lymphoid (H9/HTLVIIIB and J1.1) and pro-monocytic (U1) HIV-1 persistently-infected cell lines were treated with hydrogen peroxide (H2O2) and staurosporine (STS) for 24 h, and susceptibility to apoptosis was evaluated and compared with uninfected counterparts (H9, Jurkat and U937 respectively). When exposed to different pro-apoptotic stimuli, all persistently-infected cell lines showed a dramatic reduction in the frequency of apoptotic cells in comparison with uninfected cells. This effect was independent of the magnitude of viral replication, since the induction of viral production in lymphoid or pro-monocytic cells by exposure to TNF-alpha or PMA did not significantly change their susceptibility to H2O2- or STS-induced cell death. A mechanistic analysis revealed significant diferences in mitochondrial membrane potential (MMP) and caspase-3 activation between uninfected and persistently-infected cells. In addition, Western blot assays showed a dramatic reduction of the levels of pro-apototic Bax in mitochondria of persistently-infected cells treated with H2O2 or STS, but not in uninfected cells. CONCLUSION: This study represents the first evidence showing that resistance to apoptosis in persistently-infected lymphoid and monocytic cells is independent of active viral production and involves modulation of the mitochondrial pathway. Understanding this effect is critical to specifically target the persistence of viral reservoirs, and provide insights for future therapeutic strategies in order to promote complete viral eradication.

Oxidative stress in vero cells infected with vesicular stomatitis virus.

Viral-induced apoptosis might be mediated by oxidative stress. It has already been described that cell death in vesicular stomatitis virus (VSV)-infected cells occurs by apoptosis. In this study, oxidative stress parameters present in VSV-infected Vero cells were analyzed. Lipid peroxides (LP) were evaluated in cellular extracts and expressed as thiobarbituric acid-reactive substances. LP levels exhibited a rise at different times post infection, according to the multiplicity of infection (MOI), while the presence of cycloheximide determined a reduction on LP. Also, an increase in protein degradation products and a decrease in polyunsaturated fatty acids content was observed, indicating that cellular proteins and lipids began to be susceptible to degradation during VSV infection. In addition, we analyzed cell viability of VSV-infected Vero cells, which were incubated in the presence of butylated hydroxyanisole. This antioxidant was able to protect Vero cells, at least at MOIs assayed in this study, and to reduce viral yield only when VSV infection was done at MOI 0.05. Further, superoxide dismutases, which occupy the first step within the antioxidant enzyme cascade, also exhibit a rise in VSV-infected Vero cells, at different MOI. These results suggest that both an oxidative stress and an antioxidative cell response precede the induction of apoptosis by VSV.

Early activation of the mitochondrial apoptotic pathway in Vesicular Stomatitis virus-infected cells.

Vesicular Stomatitis Virus (VSV) has been shown to induce apoptosis in a caspase-dependent manner, but the precise apoptotic pathway remains unknown. We found that caspases 9 and 3, but not caspase 8, were activated during VSV-induced apoptosis in infected Vero cells. Since caspase 9 is related to the mitochondrial apoptotic pathway, we analyzed some mitochondrial events such as changes in the mitochondrial transmembrane potential (Deltapsim) and mitochondrial release of apoptogenic proteins such as cytochrome c and the apoptosis inducing factor (AIF). We found that VSV infection triggers the dissipation of the Deltapsim and the release of both cytochrome c and AIF from the mitochondrial intermembrane space very early in the VSV infection. These results indicate that the trigger of apoptosis in VSV-infected cells occurs through the early activation of the mitochondrial apoptotic pathway. On the other hand, intracellular levels of the anti-apoptotic proteins, such as Bcl-2 and Bcl-xL, and the pro-apoptotic protein Bax, were assessed during viral infection. These analyses showed that as viral infection proceeded, the cellular level of Bcl-xL decreased, while the levels of Bax and Bcl-2 remained unaffected. The significance of the Bcl-xL modulation is also discussed.

Nuevas estrategias terapéuticas basadas en apoptosis y virus / Viruses and apoptosis-based therapeutic agents in human diseases

En éste trabajo se presentan los mecanismos y las moléculas que participan de la apoptosis en células de mamífero. Se discute la función de la mitocondria, se relacionan los distintos controles del sistema con patologías humanas y se presentan algunos virus neurotrópicos donde existe una importante conexión con la apoptosis. Asimismo, se indican algunos factores participantes del proceso que tienen una veta promisoria en el tratamiento de enfermedades donde la desregulación de la muerte celular programada es la causa de la patología en cuestión

Nuevas estrategias terapéuticas basadas en apoptosis y virus / Viruses and apoptosis-based therapeutic agents in human diseases

En éste trabajo se presentan los mecanismos y las moléculas que participan de la apoptosis en células de mamífero. Se discute la función de la mitocondria, se relacionan los distintos controles del sistema con patologías humanas y se presentan algunos virus neurotrópicos donde existe una importante conexión con la apoptosis. Asimismo, se indican algunos factores participantes del proceso que tienen una veta promisoria en el tratamiento de enfermedades donde la desregulación de la muerte celular programada es la causa de la patología en cuestión (AU)

Compuestos lisosomotrópicos inhibidores de la multiplicación del virus Junín / Lysosomotropic compounds inhibiting the multiplication of Junin virus

La multiplicación del virus Junín en células Vero fue inhibida por la acción de drogas lisosomotrópicas de carácter básico como cloruro de amonio, clorhidrato de procaína y clorofeniramina. El efecto inhibitorio del cloruro de amonio (15mM) es máximo cuando la droga es agregada junto con el inóculo viral o inmediatamente después de la infección, pero aun agregado 8 horas después de la infección produce una inhibición significativa del 97,8%. Estos resultados indicarían que la droga actúa fundamentalmente sobre una etapa temprana del ciclo de multiplicación viral. Por lo tanto, el mecanismo de entrada del virus Junín a la célula transcurriría a través de una endocitosis mediada por receptor (AU)

Compuestos lisosomotrópicos inhibidores de la multiplicación del virus Junín / Lysosomotropic compounds inhibiting the multiplication of Junin virus

La multiplicación del virus Junín en células Vero fue inhibida por la acción de drogas lisosomotrópicas de carácter básico como cloruro de amonio, clorhidrato de procaína y clorofeniramina. El efecto inhibitorio del cloruro de amonio (15mM) es máximo cuando la droga es agregada junto con el inóculo viral o inmediatamente después de la infección, pero aun agregado 8 horas después de la infección produce una inhibición significativa del 97,8%. Estos resultados indicarían que la droga actúa fundamentalmente sobre una etapa temprana del ciclo de multiplicación viral. Por lo tanto, el mecanismo de entrada del virus Junín a la célula transcurriría a través de una endocitosis mediada por receptor

Atenuación en la virulencia para ratón lactante de una mutante de virus Junin / Attenuation of virulence in suckling mice of a mutant of Junin virus

En este trabajo se describen las características de una mutante termosensible de virus Junín, denominada C167, que se destaca por su marcada atenuación para ratón lactante. La menor patogenicidad de C167 para este huésped experimental respecto de XJC13 se manifiesta en animales de distintas edades al momento de la inoculación, que van desde los 2 hasta los 14 días de edad. Las mayores diferencias entre ambos virus se registran para el ratón de 2 días de edad, en el que los índices de letalidad, expresados como la relación DICT50/DL50, son de 4,4 y >- 580, para XJC13 y C167, respectivamente. Esta atenuación tambien se manifiesta por un sensible retraso en el día promedio de muerte en los pocos animales que mueren por inoculación de C167. Además, la mutante muestra un crescimiento sumamente restringido y lento en cerebro de ratón lactante respecto de la cepa parental, mientras que las curvas de crecimiento en células Vero para ambos virus siguen un patrón similar. Por otra parte, no se detectaron diferencias a nivel antigénico entre la mutante y la cepa parenteral a través de reacciones de neutralización cruzada con sueros hiperinmunes

Atenuación en la virulencia para ratón lactante de una mutante de virus Junin / Attenuation of virulence in suckling mice of a mutant of Junin virus

En este trabajo se describen las características de una mutante termosensible de virus Junín, denominada C167, que se destaca por su marcada atenuación para ratón lactante. La menor patogenicidad de C167 para este huésped experimental respecto de XJC13 se manifiesta en animales de distintas edades al momento de la inoculación, que van desde los 2 hasta los 14 días de edad. Las mayores diferencias entre ambos virus se registran para el ratón de 2 días de edad, en el que los índices de letalidad, expresados como la relación DICT50/DL50, son de 4,4 y >- 580, para XJC13 y C167, respectivamente. Esta atenuación tambien se manifiesta por un sensible retraso en el día promedio de muerte en los pocos animales que mueren por inoculación de C167. Además, la mutante muestra un crescimiento sumamente restringido y lento en cerebro de ratón lactante respecto de la cepa parental, mientras que las curvas de crecimiento en células Vero para ambos virus siguen un patrón similar. Por otra parte, no se detectaron diferencias a nivel antigénico entre la mutante y la cepa parenteral a través de reacciones de neutralización cruzada con sueros hiperinmunes (AU)